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技术简介

 

        实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。

 

 

技术原理

 

在Real-time qPCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续的分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反映早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并由此来推断模板最初的含量。

 

技术优势

 

1. 通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板,具有很高的准确性,假阳性低,特异性好。

2. 光谱技术和计算机技术的联合使用,极大提高了检测灵敏度,甚至可以检测到单拷贝的基因。

3. 不受扩增效率和试剂损耗的影响,可以利用指数期的Ct值定量起始模板量,精确性高。

4. 可以将扩增和检测同步完成,不需开盖,不仅交叉污染和环境污染机会少,且自动化程度高。

5. 没有后处理,不用杂交、电泳、拍照,实时缩短了反应时间。

 

应用范围

 

1. DNARNA的绝对定量分析,包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测。

2. 基因表达差异分析,例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA差显结果的确证。

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